Fragmentation d’ADN pour séquençage haut débit

L’AFA® : le choix de la qualité, de la robustesse, et de la reproductibilité

Le séquençage très haut débit (NGS) permet diverses applications telles que : le MethylSeq, Tumor Burden, RNAseq, WES, WGS, Shallow, CHIPseq … qui nécessitent de choisir la plus sûre solution de préparation de bibliothèque. Nous avons demandé au fameux Pr. Murphy les raisons de recommander les kits utilisant l’AFA® de Covaris pour la fragmentation d’ADN.

Une chose fastidieuse dans la préparation des échantillons ChIP est l'optimisation et la ré-optimisation du cisaillement de la chromatine. Avez-vous des conseils et des astuces à ce sujet ?

Je suis d'accord pour dire que pour obtenir des résultats solides, il faut optimiser le cisaillement de la chromatine. Cependant, avec la technologie Covaris et notre kit de préparation d'échantillons, cela est possible en moins d'une semaine. Il n’est pas nécessaire de réoptimiser les paramètres pour le même matériel d'entrée après une première optimisation du temps de cisaillement. Il n'est pas non plus nécessaire d'optimiser les paramètres pour chaque quantité d'échantillon, car le cisaillement de la chromatine de Covaris est très robuste et indépendant de la concentration dans une large gamme d'échantillons (des cellules 3M à 30M peuvent par exemple être cisaillées dans les mêmes conditions).

Quel est le secret de Covaris, pourquoi dites-vous que vous pouvez assurer ce niveau de fiabilité et de reproductibilité ?

C'est principalement parce que nous fournissons une solution complète et que nous contrôlons chaque étape de l'ensemble du processus. Nous concevons non seulement les ultrasons Covaris, mais aussi les consommables de qualité AFA qui font partie intégrante de l'alimentation en énergie hautement précise et reproductible. De plus, nous fournissons un logiciel développé par Covaris, et notre équipe d'ingénieurs de service assure une maintenance compétente de nos instruments.

Cependant, pour certains types de cellules comme les cellules mononucléaires du sang périphérique (PBMC), j'observe souvent un cisaillement inefficace de la chromatine ; pensez-vous que leur structure chromatinienne soit si particulière ?

D'après notre expérience, nous lions plutôt ce phénomène à une lyse cellulaire incomplète lors de la préparation de l'échantillon de chromatine. Bien que la plupart des types de cellules affichent des résultats standardisés de cisaillement de la chromatine avec notre kit truChIP, nous comprenons que certaines cellules sont résistantes à la lyse chimique seulement, par exemple, les PMBCs, les cellules très mésenchymateuses ainsi que plusieurs cellules primaires.

Par conséquent, nous suggérons de soutenir la lyse chimique par une lyse mécanique en utilisant l'AFA de Covaris dans une approche appelée Extraction de noyaux par SONication (NEXSON). Cela permet un cisaillement de la chromatine robuste, facile et reproductible à partir d'un matériel d'entrée difficile.

Ce NEXSON semble très intéressant, fonctionne-t-il également sur des échantillons de tissus et est-il utilisé pour d'autres applications que le ChIP classique ?

Vous êtes intelligent, je dois l'admettre. En effet, il est utilisé entre-temps pour tout flux de travail qui nécessite l'extraction de noyaux et il y a beaucoup de publications sur les approches HiC par exemple. De plus, il a été démontré qu'elle fonctionne bien sur des échantillons de tissus fixés.

Dans l'ensemble, tout cela semble très intéressant, et mes collègues m'ont souvent dit que Covaris fournit une préparation d'échantillons et un cisaillement de la chromatine très robustes, mais mes recherches nécessitent un débit d'échantillons énorme. Avez-vous des solutions pour des lots d'échantillons plus importants ?

Nous pouvons offrir des solutions pour jusqu'à 96 échantillons sans compromettre la reproductibilité et la fiabilité des échantillons.

Nous sommes également flexibles dans les possibilités de mise à niveau qui permettent d'accroître les capacités de votre système parallèlement à votre débit et à vos exigences scientifiques. En d'autres termes, vous pouvez commencer avec un instrument à 8 échantillons et passer à 96 puits au fur et à mesure que votre débit augmente sans avoir à ré-optimiser vos paramètres de cisaillement.

Certes, cela semble très convaincant, mais la solution de Covaris semble également assez coûteuse.

Cela dépend du pourcentage de votre traitement d'échantillons de bout en bout représentant la préparation des échantillons. Dans le cas d'applications en aval coûteuses telles que (Hi)ChIP-Seq ou HiC, les scientifiques n'ont généralement pas l'intention d'économiser quelques euros par échantillon lors de la préparation initiale de la chromatine et du cisaillement. De tels essais nécessitent des protocoles coûteux et longs impliquant des anticorps onéreux, la préparation de bibliothèques et des coûts de séquençage. De plus, la disponibilité du temps d'exécution du séquençage ainsi que le support bioinformatique sont précieux et une répétition des expériences due à une préparation inappropriée de l'échantillon n'est pas possible, surtout lorsqu'on part d'échantillons cliniques rares et précieux. En outre, plusieurs projets nécessitent des études de suivi sur plusieurs années, raison pour laquelle les scientifiques doivent assurer un cisaillement standardisé et reproductible des échantillons sur une longue période (souvent plusieurs années).

En résumé, je conclurais plutôt que la préparation et le cisaillement cohérents des échantillons permettent d'économiser du temps et des ressources et d'accélérer vos travaux scientifiques.

Merci beaucoup pour votre temps et le partage de vos connaissances ! Si je souhaite en savoir plus sur les flux de travail de préparation des échantillons pour la préparation et le cisaillement de la chromatine ou si je veux résoudre le problème de ma propre expérience, pourriez-vous me suggérer le moyen le plus simple de progresser ?

Mes collègues de Covaris et moi-même sommes toujours heureux de discuter de science, alors si vous voulez nous faire plaisir, parlez-nous de votre projet scientifique et contactez mon équipe pour un dépannage. Pour une lecture plus approfondie, je vous suggère de consulter notre brochure sur l'épigénétique qui résume tous les flux de travail épigénétiques et partage la documentation pour chaque application avec les paramètres initiaux sur les appareils Covaris.