Fragmentation d’ADN pour séquençage haut débit
L’AFA® : le choix de la qualité, de la robustesse, et de la reproductibilité
Le séquençage très haut débit (NGS) permet diverses applications telles que : le MethylSeq, Tumor Burden, RNAseq, WES, WGS, Shallow, CHIPseq … qui nécessitent de choisir la plus sûre solution de préparation de bibliothèque. Nous avons demandé au fameux Pr. Murphy les raisons de recommander les kits utilisant l’AFA® de Covaris pour la fragmentation d’ADN.
Professeur Murphy, quels sont selon vous les enjeux actuels et à venir dans l’analyse des protéines ?
Les analyses de protéines se perfectionnent et sont plus sensibles : la spectrométrie de masse, les techniques de détection par affinité avec des ligands (Elisas ou méthodes multiplex avec des anticorps ou des aptamères) ont atteint des limites de détection très basses et couvrent des gammes dynamiques très larges, ce qui requiert une préparation d’échantillons robuste et reproductible.
En parallèle il y a une demande croissante de données en protéomique, et toujours plus d’échantillons à analyser simultanément, entraînant un nécessaire changement d’échelle car les volumes se réduisent, ainsi que la quantité de matériel de départ.
Enfin, ces méthodes se doivent d’être rapides et de nécessiter le moins possible d’intervention humaine.
La technologie AFA répond à ces différentes exigences : robustesse, reproductibilité, automatisation caractérisent nos instruments.
Qu’est-ce que l’AFA® ?
Le sigle correspond à « Adaptive Focused Accoustic » : il s’agit d’ondes acoustiques de haute fréquence qui sont focalisées à l’intérieur de chaque puits. L’énergie acoustique par la nucléation permet de fragmenter l’ADN, de « mixer », de casser (lyse cellulaire), de déparaffiner… C’est une technologie sans contact permettant de contrôler l’énergie émise et la température au niveau de l’échantillon, ce qui assure une meilleure préservation des protéines, en particulier dans des volumes réduits (1 à 100uL).
Il existe maintenant une large gamme d’appareils équipés de cette technologie, permettant d’accompagner chaque laboratoire dans ses besoins actuels et ses changements d’échelle futurs, avec des prix de 20k€ à 200k€.
En quoi une préparation des échantillons incluant l’AFA® est-elle pertinente ?
C’est une extraction rapide et reproductible grâce à un élément clé de nos appareils : le transducteur (émetteur d’énergie) linéaire: les échantillons sont ainsi traités en simultané, avec des paramètres identiques. Une fonction de scanning permet d’appliquer ce principe à des plaques de 96 ou 384 puits. C’est une extraction robuste et flexible: de multiples tampons différents ont été testés, sur des échantillons très variés, et sans biais d’extraction (toutes les catégories de protéines sont présentes).Elle est également compatible avec une purification d’autres biomolécules d’intérêt.
La mise en échelle de grandes séries avec faible volume est aisée : l’efficacité de l’AFA® permet de traiter des petits ou très petits volume (1-100µL) dans divers formats (barrettes, plaques 96 puits, plaques384 puits) et les instruments intègrent l’automatisation nécessaire au changement d’échelle (système « plug and play »).
C’est enfin un moyen de réduction des biais expérimentaux : travailler en plus petit volume et avec moins de transferts successifs permet de limiter les contaminations et les pertes de matériel biologique. En ce sens, notre compatibilité avec la méthode SP3 (single pot solid phase sample preparation) est un atout important, permettant de nettoyer et digérer les protéines dans la même plaque que pour la lyse ou la fragmentation de l’ADN génomique (qui réduit la viscosité).
En somme, c’est la meilleure solution pour standardiser les protocoles de préparation d’échantillons ! Vous parlez d’échantillons très variés : quels types d’échantillons au juste?
Plus de 150 publications recensent l’utilisation de Covaris pour l’extraction de protéines (mais aussi de métabolites ou de lipides) sur des échantillons comme les tissus frais ou congelés, les tissus fixés et paraffinés (FFPE), les microdissections laser (LCM) les cultures de cellules (homme ou animal), les bactéries (Gram +, Gram -, Mycobactéries), les levures, les plantes, ou des petits organismes (insectes…). Les volumes (et les tampons) peuvent être aisément adaptés à la quantité de matériel de départ.
Avez-vous des exemples récents de sites équipés en Covaris pour l’analyse protéique ?
De nombreux sites de pointe nous ont fait confiance depuis deux ans comme l’Institut Pasteur de Paris, le centre allemand du cancer à Heidelberg (DKFZ), le Max Planck Institute de Munich, l’Hopital Charité de Berlin, le Novo Nordisk Center for Protein research à Copenhague, le Memorial Sloan Kettering Cancer Center à new York ou la société Biognosys en Suisse. Ils optent généralement pour des instruments flexibles, type LE220Rsc ou LE220R-plus, permettant de traiter divers formats de consommables, dont nos plaques 96 et 384 puits. Cela leur permet de s’adapter en permanence à la taille des études et cohortes qui leur sont confiées. Ces instruments sont également compatibles avec des robots pipeteurs.
Est-ce une méthode réservée à de très hauts débits ?
Pas du tout. Notre force est de pouvoir proposer cette technologie aussi bien en tube individuel qu’en barrette ou en plaque. Nous avons fourni des efforts de développement significatifs pour proposer l’accès à cette technologie reconnue à moindre coût avec 2 nouveaux appareils, le R230 et le ML230.
C’est une étape importante dans le changement d’échelle en préparation d’échantillons. Il devient possible d’harmoniser la préparation aussi bien en barrette (ML230) qu’en plaque (R230) tout en conservant de la flexibilité sur les formats : pour des besoins ponctuels, le ML230 peut traiter des tubes jusqu’à 500uL, et le R230 pourra aussi traiter des barrettes.
Avez-vous des exemples en R230 ou ML230 ?
Comme ce sont des instruments plus récents, notre base installée est en développement. Plusieurs sociétés privées aux Etats-Unis ont adopté le ML230 pour leurs groupes de R&D, et envisagent ensuite de passer sur le R230 pour les services travaillant à plus grande échelle. Le R230 a été installé à l’université d’Oxford et intéresse de nombreux laboratoires d’analyse protéique comme au Cedars Sinai de Los Angeles ou au Boston Children’s Hospital.
Cela semble très clair. Un dernier mot ?
Quel que soit votre besoin lié à l’extraction de protéines (ou de métabolites et de lipides), contactez-nous pour faire un point sur vos protocoles et voir quelles optimisations sont possibles !
Merci Professeur Murphy!
Rendez-vous le mois prochain pour votre dernière intervention « omique » !
Si vous souhaitez de plus amples informations, rendez-vous sur notre site internet www.covaris.com ou demandez à être recontacté par notre équipe.