Fragmentation d’ADN pour séquençage haut débit

L’AFA® : le choix de la qualité, de la robustesse, et de la reproductibilité

Le séquençage très haut débit (NGS) permet diverses applications telles que : le MethylSeq, Tumor Burden, RNAseq, WES, WGS, Shallow, CHIPseq … qui nécessitent de choisir la plus sûre solution de préparation de bibliothèque. Nous avons demandé au fameux Pr. Murphy les raisons de recommander les kits utilisant l’AFA® de Covaris pour la fragmentation d’ADN.

Qu’est-ce que l’AFA^® Pr Murphy?

Le sigle correspond à « Adaptive Focused Accoustic », en d’autres termes il s’agit d’ondes acoustiques de haute fréquence qui sont focalisées à l’intérieur de chaque puit. L’énergie acoustique par la nucléation permet de fragmenter l’ADN, de « mixer », de casser (lyse cellulaire), de déparaffiner… tout en contrôlant l’énergie émise et la température du système.

Les appareils de Covaris sont ainsi multi OMICS et font preuve d’une grande flexibilité pour les types de consommables (tubes, barrettes et plaques) et des volumes d’échantillons.

En quoi c’est une technologie sûre et reconnue ?

La technologie AFA^® est la plus utilisée pour le séquençage de génomes et d’exomes, ainsi que pour les séquences difficiles (riches en GC, séquences répétées). Covaris est d’ailleurs cité par les fournisseurs de kits comme une référence pour comparer leurs kits en version enzymatiques.

Les utilisateurs avec des hauts débits tels que Sanger Institute, Decode, DKFZ, Seqoia, Auragen … utilisent les appareils Covaris pour leur robustesse et leur reproductibilité limitant ainsi au maximum les échecs dans la préparation de librairies.

Pourquoi est-il préférable d’utiliser l’AFA^® pour les préparations de librairies ?

Pour éviter les biais liés aux enzymes qui réduisent la diversité des fragments générés diminuant ainsi la couverture et l’uniformité. Lorsque la matrice de l’ADN est en mauvais état (à partir de tissus FFPE), ou qu’il y a peu d’ADN (biopsie pédiatrique), qu’est recherchée de la sensibilité (CNV, Shallow, Somatique …), Covaris fonctionne là où les autres méthodes sont très souvent mises en échec.

Il est vrai que les enzymes fonctionnent bien pour le sang et les tissus frais, mais avec un moins bon CV et un taux d’échec plus important : la variabilité des extractions, la présence d’inhibiteurs, la variabilité des quantités … sont autant d’éléments qui n’affectent pas l’efficacité de la fragmentation mécanique et qui produisent un profil fin de distribution des tailles.

Economique, vraiment Pr Murphy ?

Le coût d’une librairie et du séquençage est important. Le temps qui s’écoule depuis la préparation des échantillons jusqu’aux résultats bio-informatiques est conséquent, et devient une perte sèche lorsque les mutations ne sont pas trouvées (couverture insuffisante, uniformité insuffisante …).

Il est toujours possible de multiplier les étapes de QC pour réduire les difficultés directement liées à une fragmentation inefficiente ou d’augmenter la profondeur de séquençage. Mais cela ajoute des coûts et des délais supplémentaires.

Il est vrai que les enzymes ne nécessitent pas d’investissement matériel, mais c’est bien là le seul avantage. Covaris a fourni ces dernières années un effort considérable pour réduire les coûts des consommables et des machines : le ML230 et R230 en sont l’illustration parfaite.

Quelles sont les marques qui commercialisent les kits de préparation de librairies utilisant l’AFA® ?

Je dirais toutes ou presque. Lors de nouveaux tests, vous pouvez demander à votre fournisseur de tester aussi la version mécanique et nous vous invitons à nous contacter :

-pour le prêt d’une machine si besoin
-et surtout pour vous donner les meilleurs paramètres
-vous les trouverez aussi sur notre site à la page de chaque modèle d’instrument

Qu’en est-il de l’automatisation Pr Murphy ?

Si vous êtes d’accord parlons consommables et instruments.

Les nouvelles générations de consommables sont fabriquées à partir d’un plastique adapté aux ultrasons. Ils sont traités pour créer entre autres des sites de nucléation au fond de chaque puit, éliminant ainsi la fibre des anciens consommables. Cela permet un pipetage plus facile et une robotisation possible des consommables. En plus ils sont moins chers !

Certains modèles d’instruments de Covaris possèdent à la place d’une porte, un rideau lumineux pilotable par les robots pipeteurs, facilitant ainsi l’automatisation.

Enfin le R230 est intégrable à l’intérieur même des robots ne nécessitant plus la sortie du bras robotisé. Par ailleurs le R230 fonctionne aussi sans intégration.

Comment voyez-vous l’avenir pour le NGS et Covaris Pr Murphy?

Très bonne question mais je n’ai pas de boule de cristal.

Je peux néanmoins vous parler des pistes que nous explorons : faible volume et PCR free pour l’ADN en 96 ou 384 puits.

Je crois qu’il y aura des parts belles faites pour le RNAseq et l’épigénétique. Le méthylseq est de plus en plus fréquemment utilisé.

Nous pensons chez Covaris que la préparation d’échantillon est la clé de réussite des analyses. L’impératif est de préserver les informations détenues par les échantillons, il nous semble important de créer un environnement de traitement contrôlé et extrêmement reproductible qui préserve l’échantillon lors de la préparation - notamment pour le haut débit qui exige un taux d’échecs le plus bas possible.

Pour exemple, nous développons des protocoles qui à partir de lyse cellulaire permettent d’obtenir des ADN longs ou des ARN avec un très bon DV200 pour une préparation de librairies avec un nombre très limité de transfert d’échantillon.

Que dites-vous aux sites qui utilisent la fragmentation enzymatique ?

Je vous renvoie à la question 4 : nous comprenons que comparé aux kits avec enzymes, il y a dans notre cas l’investissement dans un appareil. Il s’agit d’un investissement largement rentable de par la flexibilité des applications, de par la sécurité des résultats et de l’économie de temps que ça engendre.

J’ai un exemple très intéressant à partager, nous en avons d’ailleurs tiré une note technique que vous pouvez consulter.

L'hôpital Radboud UMC a amélioré son flux de travail en passant de librairies basées sur la fragmentation enzymatique à l’AFA® de Covaris. Deux R230 ont été intégrés à des automates de pipetage rendant leur processus plus fiable et plus rentable. Pourtant la majorité de leurs échantillons sont du sang et du tissu frais, et ils exercent principalement sur les maladies rares (l’oncologie somatique nécessitent plus de profondeur).

Est-il possible de tester un de vos appareils ?

Je vous propose de contacter nos représentants Covaris pour une présentation complète et une évaluation de vos besoins. Nous serons heureux de vous informer du mieux possible.